高校在多重端粒荧光原位杂交实验

一、固定的中期染色体细胞悬液的制备


（1）外周血样品

1.37℃水浴锅内预热RPMI-1640培养基、FCS、L-谷氨酰胺和青霉素/链霉素。

2.在二级细胞培养用超净台中，无菌条件下配制完全培μ基：100mL FCS、5mL L-谷氨酰胺、5mL青霉素/链霉素，加RPMI-1640至500ml。3.在2个Nunc培养管中，各加0.25mL外周血、5mL完全培养基、PHA(终浓度2%)。

4.37℃培养箱中孵育72h。

5.加10OpL15mg/mL的胸苷到每个培养物中，轻轻混匀。

6.37℃培养箱中孵育16〜18h。

7.180g离心5min。

8.弃上清，用5mL完全培养重悬细胞。

9.180g离心5min。

10.弃上清，用5mL完全培养重悬细胞团块。

11.37℃条件下孵育5h。

12.加100/×L10jLtg/mLKaryoMa×秋水酰胺。

13.37℃条件下孵育10min。

14.180g•离心5min。

15.弃上清，用37℃预热的7mL0.075mol/L KCl悬起细胞团块。

16.37℃条件下孵育15min。

17.180g离心5min。

18.弃上清。

19.将管子放在涡旋振荡器上以中速振荡，缓慢滴加预冷的甲醇：冰乙酸(3:1)固定液到细胞中。当细胞悬液变成褐色时，加速滴加固定液，至总体积5mL。

20.180g离心5min，弃上清。

21.加5mL预冷的固定液。

22.180g•离心5min，弃上清。

23.加5mL预冷的固定液。

24.180g离心5min，弃上清。

25.加3mL预冷的固定液重悬细胞。

26.储存在-20℃条件下备用。


（2）来自永生化淋巴细胞株

1.增殖细胞，直至全培基到50mL。.

2.收获细胞前的18〜24h，更换新鲜培养液。

3.收获时，将20mL生长良好的细胞移到50mL离心管中。

4.加200ΜL浓度为10μ×g/mL秋水酰胺，轻轻混匀。

5.37℃条件下孵育50〜60min。

6.180g离心5min。箱或水浴箱)。

5.预热Multiprobe®装置，探针面朝上（即突出表面朝上，标记表面朝下），不要接触突出方形块的表面。

6.准备一个染色缸装2×SSC，三个染色缸分别装70%、85%和100%的乙醇系列。

7.用2×SSC洗点好样的片子2min，然后依次在70%、85%和100%的乙醇中各脱水2min。

8.片子空气干燥后，有样品一面朝上的放在37℃加热板上。

9.同时，用10斗移液器取2,预热杂交液点到Multiprobe®装置上的突出方形块上（放置在37℃加热块上）。

10.小心翻转片子（点样品面朝下），使之与Multiprobe®装置上相应的方块接触，组装到Multiprobe®装置上;也就是方块1在Multiprobe®装置的最右上角。

11.小心地提起组装好的装置，翻转使片子在Multiprobe®装置的下面。

12.放在37℃加热板上10min。

13.将组装好的装置保持水平小心地转移到75℃加热板上。

14.变性1〜3min，变性时间取决于固定的染色体悬液时间长短。

15.立即转移组装好的装置到预热的ChromoprobeMultiprobe®杂交室（或者避光塑料玻片盒）中，更换盖子，然后在去盖的水浴锅中过夜。

二、

（4）杂交后洗脱和封片

1.将洗脱液I倒入干净的染色缸中，水浴中预温至72℃后，调整pH至7.0。

2.将洗脱液II倒入干净的染色缸中，室温（20〜25℃)放置。

3.从杂交室中取出组装好的Multiprobe®装置。

4.小心卸下Multiprobe®装置，立即将片子放在洗脱液I中2min，用镊子夹住片子，轻轻的上下振荡。

5.转移到洗脱液II中30s。

6.夹住片子的长边，在纸上沥去过量液体10〜20s，但注意玻片表面不能干。

7.加20μL含DAPI的抗淬灭剂溶液到盖玻片（24mm×60mm，试剂盒中提供）的两端，轻轻地将片子上的杂交区域压到盖玻片上。

8.检查复染的区域，用钝头镊子轻轻按压排掉气泡。

9.将吸水纸盖在标本上方，轻轻按压以除去过量的液体。

10.将指甲油涂在盖玻片周围来封片。

11.观察前至少在黑盒或玻片夹中放置至少10min以备阅片。


（5）荧光显微镜下分析杂交后的片子

1.将标本放在显微镜载物台上。

2.使用10倍的物镜和DAPI滤光片观察第一方块，观察单个细胞的中期染色体。

3.加镜油到方形块，转换成100倍的油镜。

4.转换到三通滤光片（DAPI/FITC/德克萨斯红）观察中期染色体。

5.计数绿色短臂信号和长臂红色端粒信号，并记录染色体的位置。第一方块的正常实验结果是1号染色体上有两个绿色信号在短臂端粒区，两个红色信号在长臂端粒区。

6.分别用FITC滤光片或德克萨斯红滤光片确认实验结果。

7.重复步骤2〜6,直到该孔中不同的5个中期分裂相均得到明确的结果。

8.每个孔的检测都重复步骤2〜7。

9.记录分析结果，任何不正常的结果或者某些探针杂交结果不满意时，应该用这些探针重做杂交实验。

10.确认异常时采用患者的新鲜样本，可能的话同时分析父母样本，这样将有助于判定异常是否是真异常（如果为真异常的话，确定是原发的还是家族遗传的），还是良性多态变异的结果。


三、端粒克隆DNA的抽提

1.准备含特定抗生素50μg/mL氨苄青霉素、35μg/mL卡那霉素或12.5μg/mL氯霉素）的LB平板。

2.从-70℃取出甘油保存管，放在干冰上。

3.取甘油保存的菌种在LB平板划线后，37℃细菌培养箱培养过夜。

4.加100mL 2×YT培养基到500mL离心管中，按步骤1所示浓度加抗生素。

5.从平板上挑选单克隆接种到2×YT培养基，37℃摇床中培养过夜。

6.取700μL细菌培养物加300μL100%甘油混合均匀，分装在两个Eppendorf管中，标记好，-70℃条件下保存。

7.剩余的细菌培养物350g离心15min。

8.弃上清，将离心管倒扣在纸上沥干。

9.用30mL冷的细胞重悬液悬起沉淀，剧烈混匀和抽吸几次，使得小细胞团块彻底悬起10.加30mL细胞裂解液，上下轻轻颠倒一次。

11.室温放置5min(不要延长时间）。

12.立即加30mL冷的中和液，上下轻轻颠倒混匀。

13.冰上放置15min，每5min上下颠倒几次。

14.4℃下4000g•离心40min。

15.标记好一个新的250mL离心管，上面放一个塑料漏斗。

16.剪一个圆形的杂交网筛，中间剪开一个裂缝，装到漏斗上。

17.小心将离心的上清倒在网筛上，液体经过网筛和漏斗收集到250mL离心管里，注意不要有絮状物穿过网筛。

18.移去漏斗、网筛，用水、乙醇清洗以备下次使用。

19.加0.7倍体积的无水异丙醇沉淀DNA。

20.混合均匀，4000g离心10min。

21.弃上清，加入25mL70%乙醇。

22.振荡混匀，4000g离心10min。

23.弃上清，将离心管倒扣在纸上以去掉多余液体。

24.用1mL TE(pH8.0)重悬DNA沉淀。

25．取5μL抽提的DNA在0.9%的凝胶上电泳检测，用Xmnd III DNA作为参考标准，完整的黏粒大小应该在大分子质量的位置。

26.测量抽提的DNA浓度（如使用荧光光度计)。

27.在-20℃储存抽提的DNA。

四、用缺口平移法间接标记端粒克隆DNA

1.将Eppendorf管放在冰上，然后加入1.0μg待标记DNA、1.2μL生物素-16-dUTP(如果标记短臂探针）或地高辛-11-dUTP(如标记长臂探针）等，加蒸馏水至总体积50μL。

2.轻轻振荡，稍离心以去气泡。

3.在15℃水浴中反应90min。

4.将反应体系放在冰上暂停反应。

5.取5μL在2%的琼脂糖凝胶上检测片段大小，用Phi×174作为DNA大小的参考标准。

6.最适于杂交的片段大小为50〜500bp条带。如果片段大于500bp，则补加1.0μL DNase I，15℃孵育30min

7.当探针大小合适时，用装有交联葡聚糖G50的SELECT-B离心柱过柱去掉未结合的核苷酸。

8.加25μL鲑鱼精DNA(若标记的探针超过1哗，则按比例增加鲑鱼精DNA。

9.加蒸馏水调整探针浓度为10ng/μL(应扣除已用于检测的探针量）。

10.记录10ng/μL探针混合物的体积。

11.每微升探针混合物加入适量的人Cot-1DNA[加入量依据探针和原始插入的片段大小而定。

12.计算好含120ng探针的人Cot-1DNA/探针混合物的体积，按体积取出移到新的Eppendorf管中。

13.在真空离心机中离心干燥Cot-1DNA/探针混合物（注意不要过于干燥)。

14.为了获得某染色体长短臂端粒特异性探针杂交液混合物，将Cot-1DNA/长臂或短臂探针混合物分别重悬在38μL杂交液中，两者合并成76μL杂交液。

15.若制备单独检测长臂或短臂端粒的探针，则将Cot-1DNA/探针混合物直接重悬在76uL杂交液中。

16．混匀后在-20℃条件下储存。

五、间接标记探针的杂交和杂交后处理

（1）杂交
1.打开加热板，调整温度到75℃并预热。

2.取18斗探针杂交液到Eppendorf管，并预热到37℃(水浴锅或加热板)。

3.按照3.2.1中所示方法调整细胞悬液至最佳浓度。

4.将高质量显微载玻片浸泡在无水甲醇中2min。

5.用干净的软纸擦干片子。

6.将10〜20；×L调整好浓度的细胞悬液滴加到载玻片的中央。

7.将标本放置干燥，用相差显微镜的1〇倍物镜检查标本的质量。

8.在磨砂处标记实验内容，用钻石笔在载玻片背面划定样品区域。

9.准备一个染色缸装2×SSC，三个染色缸依次装70%、85%和100%的乙醇。

10.将制备好的片子（用固定的细胞悬液点样）用2×SSC洗2min，然后依次在70%、85%和100%的乙醇中各脱水2min。

11.片子空气干燥后，有样品一面朝上放在37℃加热板上12.轻轻上下抽吸混匀预热的杂交液，小心不要产生气泡。

13.吸取杂交液加到钻石笔划定区域的中央。

14.小心地将一个22mm×22mm盖玻片盖到杂交液，用钝头镊子轻轻按压排掉气泡。

15.小心地将片子（盖玻片一面朝上）放在75℃加热板上。

16.变性、1〜3min，变性时间取决于细胞悬液的老化程度

17.变性后立即转移到预热的避光塑料玻片盒中，37℃水浴中杂交过夜（水浴锅不盖盖子）。


（2）杂交后洗脱、抗体检测和复染

1.准备封闭液和抗体溶液1〜3。

2.振荡抗体溶液，在微型离心机中以最大转速离心10min。避光放置，如有必要可在室温中预温。

3.加洗脱液I到干净的染色缸中，水浴中预温到72℃后调整pH至7.0。

4．加洗脱液II到干净的染色缸中，室温（20〜25℃)放置。

5.同时将用水湿润的吸水纸放在一个空的避光塑料玻片盒（如空的玻片盒）的底部。

6.用剪刀为每个标本准备4张大小约为22mm×64mm的封口膜。

7.从避光塑料盒中取出标本，在纸上快速去掉盖玻片。

8.立即将片子放在洗脱液I中2min，用镊子夹住片子，轻轻的上下振荡。

9.转移到洗脱液n中30s。

10.夹住片子的长边，在纸上沥去过量液体10〜20s，注意不要使片子表面过于干燥。

11.将片子架到预先准备好的避光塑料玻片盒子中（如玻片两端搭在玻璃棒上或盒子底部平台上），取300μL封闭液加到片子上，用封口膜覆盖，避免产生气泡。

12.盖上玻片盒盖子，37℃温箱中孵育40〜50min。

13.37℃预热1.5LST缓冲液。•

14.孵育完成后去掉封口膜，将片子放在标本架上浸泡在预热的ST缓冲液中。

15.放在摇床平台上振荡3min，将倒置的避光容器放在上面保持暗环境。

16.按步骤10所示方法沥去标本上的过量液体。

17.将片子放到避光塑料玻片盒中架子上，取80μL抗体溶液1加到杂交区域。

18.用封口膜覆盖，避免产生气泡

19.盖上盖子，37℃温箱中孵育10min。

20.去掉封口膜，将片子放在标本架上浸泡在预热的ST缓冲液。

21.放在摇床平台上避光振荡3min。•

22.倒掉原来的ST缓冲液，更换新的预热ST缓冲液。

23.重复2次步骤21和22。

24.洗完3次后，按步骤10所示方法沥去过量液体。

25.将片子放到塑料避光容器中架子上，取5OμL抗体溶液2加到杂交区域。

26.用封口膜覆盖，避免产生气泡。

27.盖上盖子，37℃温箱中孵育10min。

28.去掉封口膜，在热的新ST缓冲液中洗3次，每次3min。

29.将片子按步骤10所示沥去过量液体。

30.将片子放到塑料避光容器中架子上，取80μL抗体溶液3加到杂交区域。

31.盖上盖子，37℃温箱中孵育10min。

32.去掉封口膜，在热的新ST缓冲液洗3次，每次3min。

33.在最后ST缓冲液洗脱过程中，加大约25μLDAPI复染液到放在纸上的22mm×22mm盖玻片上。

34.将片子按步骤10所示沥去过量液体。

35.轻轻地将片子的杂交区域倒扣到加有DAPI复染液的盖玻片上。

36.将吸水纸盖在标本上方，轻轻按压以除去过量的复染液。

37.检查复染的区域，用钝头镊子轻轻按压排掉气泡。

38.将指甲油涂在盖玻片周围来封片。

39.按二、（5）中所示方法避光放置至干燥后用荧光显微镜观察。

注意事项

1.要制备高质量的染色体标本，最好使用肝素锂抗凝管收集外周血样品，样品应该室温运输并尽块进行培养。固定的细胞悬液质量随着储存时间的增加会明显下降。

2.封闭液可以大量制备，过滤后分装，可在4℃储存至6个月。

3.1mL抗体溶液4℃避光可储存1个月。

4.为避免污染，细胞培养基应使用细胞培养专用的水浴锅。

5.秋水仙胺阻止纺锤体形成，使细胞染色体阻滞在细胞分裂中期。秋水仙胺处理细胞的时间影响染色体的形态。如果处理时间太短，染色体可能会比较长，造成分裂指数较低；如果处理时间过长，染色体会太短而不适于分析。

6.低渗处理时间不够时，染色体无法从细胞中释放。处理时间过长，会造成大量细胞提前破裂。

7.尽管ChromoprobeMultiprobe®-T试剂盒提供的探针和试剂已经由Cytocell公司质检过，还是建议先使用高质量的正常对照染色体悬液进行预实验优化试剂盒杂交条件，然后再进行非常重要的待测样品的杂交。

8.尽管理想的分裂指数应>5%，但是有时会存在一些问题无法达到这个指标，例如，样品的制备时间长短或者来源（如白血病样品的有丝分裂就常常不够)。在这种情况下，应该确保在标本中央区约有5个中期分裂相。当有些样品的分裂指数非常低且样品又少的情况下，应该选择使用多色FISH技术，如MTEL来分析样品。
9.如果仅仅是少数方形块上的中期染色体不够，可以在原来上样的位置再点样。

10.可以将标本加热块翻转使得最上面是平面作为37℃加热板。但75℃电热恒温板必须是实心的，表面温度均匀。

11.最好是用一只手的食指和拇指拿住磨砂位置举起片子/Multiprobe装置，然后用另一只手的食指和拇指拿住（勿挤压装置）片子/Multiprobe装置，并翻转，可以用手掌或者用托盘托住保持水平进行转移。
12.正确的变性是很重要的。如果染色体变性时间太长，染色体会发胀并有可能沿着染色体臂留下探针信号（图2C)。相反，变性时间不够，虽然能保持染色体形态，但是如果能杂交上则杂交效率很低。总之，-20℃储存越久的细胞悬液，染色体变性时间应越长。例如，标本制备与杂交在同一天，那么变性的时间仅需要45s，然而一个样品放置超过一年，变性时间大于3min。制备时间为1〜3月的样品75℃平均变性时间是1min、15s。

13.—些显微镜的载物台使观察片子末端比较困难，如果遇到这种情况，可以采用180°旋转片子的方式使末端容易观测。

14.在记录结果以前，应该先熟悉使用的端粒克隆特点以避免发生错误的解释。某些克隆用于多态性检测是很正常的，这些克隆只和对应的同源端粒杂交，但是如果存在多态性，这些克隆仅有部分杂交上或者根本就没和同源的染色体杂交上。另外，有些克隆有交叉杂交的特点，这些克隆除了与同源的端粒杂交外，还和其他端粒杂交。举例说明，如图2中显示正常的3p3q杂交模式、2q探针多态性、12p的交叉杂交以及的一种具临床意义的不平衡端粒重排。表2列出了已知的第一代和第二代端粒克隆的多态性和交叉杂交模式。

15.当必须重复实验时，应该确定使用整个新的Multiprobe®玻片和装置是否合理。其他可选择的方式包括：①重新购买已经标记好的单个端粒探针（Cytocell公司或AppligeneOncor或Vysis);②获得一套甘油保存的端粒克隆，自己制备DNA和杂交用探针。后一种方式是比较经济的，一旦扩增克隆就可以批量标记和储存探针，合适的探针可以在-20℃至少储存2年。表1列出第一代和第二代端粒克隆有哪些，这些克隆的甘油保存株或穿刺培养物可以从何处获得;同时标记出ChromoprobeMultiprobe®-T试剂盒使用的端粒克隆。

16．—些与众不同的的结果可能反映真的亚端粒重排或者端粒多态性，但是此时更应该避免错误解释的发生。表2列举了使用第一代和第二代端粒特异性克隆探针有关的多态性和交叉杂交模式。图2是FISH实验实例

17.如果使用Cytocell公司ChromoprobeMultiprobe®-T试剂盒或其他市售试剂盒（如Vysis公司的TotelVys10nMulticolorFISHProbePanel试剂盒）就没必要制备端粒克隆DNA。但是可以获得和保存一套端粒克隆，以备少量重复实验所需。表1列出第一代和第二代端粒克隆有哪些，这些克隆的甘油保存株或穿刺培养物可以从何处获得，表1中的清单也包括ChromoprobeMultiprobe®-T试剂盒使用的端粒克隆。

18.如果没有干冰，甘油保存株可以放在冰上较短的时间，但是反复这样操作会降低甘油保存株的活性。

19.如果沉淀没能很快悬起，可以在4℃条件下放置过夜。

20.如果使用Cytocell公司ChromoprobeMultiprobe®-T系列试剂盒或其他市售试剂盒，不需进行此部分的操作

21.因为间接标记的探针可以保存2年左右，所以可以增加标记的DNA量和标记反应体积。，

22.批号不同的DNA酶可能其实际浓度也有差异，不同的模板使用的DNase用量也不同。最好在使用每一批新DNA酶时，对模板所用的酶量和反应时间进行优化，以备将来应用相同的条件标记同种模板探针。

23.每一批次探针的制备都应该优化Cot-1的使用量。Cot-1的用量应根据探针中Alu序列的含量。对端粒克隆而言，插入片段为30〜40kb的标记黏粒，Cot-1的用量一般是625ng/juL探针混合物；插入片段为小于100kb左右的PAC和小的BAC探针，Cot-1的用量一般是1哗/斗探针混合物；大的BAC探针，可加到3μL探针混合物。注意例外的是19号染色体的探针克隆，如F20643和20283需要加入10μL探针混合物。

24.如果没有电热恒温板，染色体可以在10%甲酰胺/0.1mol/L EDTA/2×SSC中70℃变性5min后，在4℃下用2×SSC洗3次，然后用系列乙醇脱水。探针混合物在加入到标本上之前进行单独变性，95℃、5min。

25.应该根据单色或双色检测的需要正确配制抗体溶液，抗体浓度是非常重要的。如果抗体的浓度太低，就可能没有杂交信号或杂交效率很低。相反，浓度太髙，可能会出现斑点样的背景，无法分辨是同源信号还是背景（图2D)。由于不同批次的抗体可能存在差异，所以在测试正式样品前，最好是先用可靠的对照探针与高质量的染色体悬液进行杂交，优化抗体稀释的浓度。

全实验内容可以查阅“多重端粒荧光原位杂交实验”全文